HPLC法测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量.doc

1、HPLC法测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量摘要：目的 本文建立了简便易行、准确的HPLC-DAD法测定越橘益视胶囊中叶黄素的含量。方法 取样品0.3g，加水溶解后再加入含0.1%BHT的丙酮，在避光低温的条件下超声提取，定容，过滤。色谱条件为资生堂MG色谱柱(4.6 mm250 mm，5m)；流动相：甲醇-甲基叔丁基醚（85:15）；流速：0.2 mL/min，柱温：25，检测波长445nm。结果 叶黄素在0.8488-42.44g (r=0.9999)之间呈良好的线性关系，平均加样回收率为96.42%，RSD为3.46%。结论 用高效液相色谱分离，二极管阵列检测器检测，测定叶黄素的方法精密度、

2、稳定性等均能满足保健食品中叶黄素分析要求，且灵敏度高，重现性好，操作简单快速，可作为越橘益视胶囊中叶黄素含量测定方法。关键词：越橘益视胶囊；叶黄素；高效液相色谱法；含量测定IDetermination of lutein in Yueju Yishi capsule by HPLCAbstract： 0bjective we systematically researched determination methods of lutein in Yueju Yishi capsule by HPLC-DAD, which is simple and accurate. Methods 0.3

3、gram sample with 5ml water to dissolve and then added about 40ml 0.1%BHT acetone was oscillated to extract the lutein in low temperature and filtrated by 0.45m filter before sample injection for detection. The Shiseido MG II C18 column(4.6 mm250 mm，5m) was used under the mobile phase of methanol-met

4、hyl tert-butyl enter (85:15,v/v)at a flow rate of 0.2mL/min. The column temperature was maintained at 25 and the detection wave length was 445nm. Results There was a good linear relationship at the ranges of 0.8488-42.44g for lutein(r=0.9999).The average recovery rate was 96.42% with relative standa

5、rd deviation (RSD) of 3.46%. Conclusion The method with HPLC separation and DAD detection can meet the requirements for analysis of lutein in health care food with features of high precision，high stability，simple and rapidIt is suitable for determination of lutein in Yueju Yishi capsule. Keywords :

6、Yueju Yishi capsule;Lutein;HPLC;Content determinationII目 录摘要-1 前言12 材料与仪器32.1 使用的主要试药及溶剂32.2 使用的主要仪器33 方法43.1 叶黄素的对照品溶液制备43.2 测定波长的选择43.3 供试品溶液的制备53.4 色谱条件53.5方法学考察54 讨论114.1 提取溶剂的选择114.2 色谱条件的选择124.3 方法学验证结果145 结论14参考文献16综 述17致 谢221 前言越橘益视胶囊以天然植物越橘提取物和叶黄素粉为主要成分，并含有多种眼睛所需的营养，能够缓解视疲劳，提高视力，具有一定的改善视力的保

7、健功能。越橘是杜鹃花科植物，多年生落叶灌木，高至40厘米，花白色或粉红色，果实为浆果，蓝色或红色，近圆形。其中蓝果越橘(俗称蓝莓)，在世界范围内栽培面积最大。其主要成分有天然视紫质（Rhodopsin）和类黄酮（Flavonoid）。视紫质是眼睛产生视觉的最基本物质，可加强适应对黑暗弱光的敏感度。类黄酮具有维生素P的活性，是保护血管的物质。叶黄素是一种具有和越橘花青素同等地位的视觉营养物质，是一种非常重要的抗氧化剂，为类胡萝卜素家族的一员，又名胡萝卜醇。叶黄素是一种无维生素A活性的类胡萝卜素，其分子式为C40H56O2，链末端含有羟基基团，其结构式如图1，是由8个异戊二烯为单位所组成的含有2个

8、羟基的共轭烯烃。易溶于氯仿、二氯化碳，可溶于正己烷，微溶于醇、醚，呈黄色。在类胡萝卜素中，叶黄素与胡萝卜素有区别。其一，分子结构的不同，叶黄素是含氧化合物，比胡萝卜素的链末端多2个羟基，普遍认为叶黄素比胡萝卜素具有更强的抗氧化性。对于机体，叶黄素可通过自由基机理抑制活性氧自由基的活性，阻止活性氧自由基破坏正常细胞，从而增强机体的免疫能力，因此叶黄素独特的化学结构不仅决定其颜色，更决定其其他的理化性质。其二，叶黄素和胡萝卜素区别之处在于，如-胡萝卜素具有2个-紫萝酮环，是最有效的维生素A原，具有维生素A的各种功能，但是人体过多食入维生素A，维生素A将在体内沉积，损害肝脏或引起维生素A的过多症。然

9、而叶黄素不具有维生素A的功能，人体过多食入，不会出现这种副作用。叶黄素存在于视网膜黄斑区的主要色素，有抗氧化和过滤蓝光的作用1，从而保护眼底组织免受光毒性伤害2。每日人体接受的光照中，短光(蓝光)对人体的伤害很大，消耗大量的叶黄素，而叶黄素在人体内不能合成，必须补充一定量的叶黄素以维持身体健康。此外，叶黄素还能减少很多种眼科疾病的发生，例如老年性视网膜黄斑变性（AMD）、白内障、结膜炎和畏光等3。因此，市场上出现了大量叶黄素保健品，为监管叶黄素保健食品的质量，建立一个快速高效分析叶黄素的方法非常必要。越橘益视胶囊的简要生产工艺如下：越橘益视胶囊以叶黄素粉、越橘提取物、牛磺酸，维生素C、天然维生

10、素E（d-生育酚醋酸酯）、柠檬酸锌、维生素A粉、食用玉米淀粉、二氧化硅、硬脂酸镁为原料，经称量备料、混合、填充、内包装、外包装等主要工艺加工制成的具有缓解视疲劳的“越橘益视胶囊”。具体工艺如下：将维生素A粉、柠檬酸钠锌加约等重量的食用玉米淀粉混合2分钟后过60目筛，然后加入约等重量的食用玉米淀粉、配方量的天然维生素E混合均匀后和配方量的其他物料加入三维混合机中，若有结团的需先过40目筛，混合30min至混合物色泽均匀后出料，备用，制囊。由于叶黄素的对温度和光照环境非常敏感4，在低温避光的环境下性质较为稳定，不易降解，而在温度高、光照强、含氧量高的条件下易降解，故要求叶黄素在提取分离和分析的过程

11、中要注意避免在高温、光照强的条件下进行，也有必要在分析的过程中加入相应的抗氧化物质来防止被测物的氧化破坏。通过查找相关的文献发现，叶黄素的提取溶剂主要有：无水乙醇、丙酮、正己烷、石油醚、二氯甲烷等，提取方法主要有：超声波提取法、微波提取法、干燥法、膜分离技术、超临界CO2萃取法、酶介质有机溶剂提取等5。由于叶黄素受热不稳定，且提取时间长易降解, 以及越橘益视胶囊中叶黄素的主要来源是叶黄素原料，不需酶解，故不考虑超临界CO2萃取法、酶介质有机溶剂提取的方法。本次试验的主要考虑采取超声方法进行提取：主要用到的溶剂有水、无水乙醇、1%BHT丙酮。经过讨论、预实验和借鉴前人的经验，本次试验通过叶黄素超

12、声提取方法提取，筛选提取溶剂，选出超声提取方法中的最优方法，最终确定最佳的叶黄素提取方法。常见的叶黄素的测定方法有，高效液相色谱法，薄层扫描法，紫外-可见分光光度法等。目前，叶黄素的主要分析方法为高效液相色谱法，特别是在定性定量中使用的非常广泛，该方法具有高效准确，灵敏度高的优点。由于公司对该产品的质量标准尚未完善，未收载越橘益视胶囊中叶黄素含量的测定方法。本文对越橘益视胶囊功效成分叶黄素进行了含量测定方法的研究，根据有效成分的理化性质、投料类型、制备工艺特点，制定该产品叶黄素的高效液相含量测定方法，并通过方法学考察的各项实验，验证了方法的可行性。有助于完善本产品的质量标准，能够更全面地保证越

13、橘益视胶囊质量。2 材料与仪器2.1使用的主要试药及溶剂使用的主要溶剂见表1、2表1 样品名称批号及生产商样品名称 批号生产商越橘益视胶囊201401汤臣倍健股份有限公司表2 试剂、药品及生产商试剂 规格生产商叶黄素标准品50mgUSP（批号G0L260）叶黄素原料汤臣倍健股份有限公司甲醇色谱纯(GR)Merck甲基叔丁基醚色谱纯(GR)Sigma-Aldrich二氯甲烷分析纯（AR）广州化学试剂厂丙酮分析纯(AR)广州化学试剂厂无水乙醇分析纯(AR)广州化学试剂厂2,6-二叔丁基对甲酚（BHT）分析纯（AR）上海润捷化学试剂有限公司2.2使用的主要仪器使用的主要仪器见表3表3 主要仪器设备型

14、号及生产家主要仪器生产商Waters Alliance e2695型高效液相色谱配2998型DAD检测器沃特斯公司色谱柱（Capcell pak C18 MG，4.6 mm250 mm，5m）资生堂（中国）投资有限公司超声波清洗机中国华南超声设备厂纯水器默克密理博实验室设备有限公司电子天平（十万分之一，41g（精细量程）/120g）梅特勒-托利多国际股份有限公司3 方法关于叶黄素的测定方法文献报道较多6-8，多为使用HPLC法，但未见测定越橘益视胶囊或相似产品中叶黄素含量的报道，本实验是用HPLC法对越橘益视胶囊中叶黄素进行含量测定，对于方法的探讨进行如下：3.1 叶黄素的对照品溶液制备 3.

15、1.1 对照品储备液称取叶黄素对照品约20mg于20mL棕色容量瓶，用二氯甲烷溶解并定容至刻度，摇匀，即得叶黄素对照品储备液，其浓度为1mg/ml。在-80冰箱避光保存3.1.2 标准曲线溶液分别精密量取对照品储备液4.00mL、3.00mL、2.00mL、1.00mL 于100ml棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得：S7、S6、S5、S4；然后精密量取S5溶液3.00mL、1.00mL于10mL棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得S3、S2；再取S5溶液1.00mL于25mL棕色容量瓶并用二氯甲烷定容至刻度，摇匀，即得S1。3.2 测定波长的选择叶黄素的结构式见下图：图1 叶黄素结构式叶黄素含有两个不同的紫罗酮环：-和-紫罗酮环，在各紫罗酮环的第三个碳原子上存在一个功能性羟基，为高度不饱和化合物9。其分子中有共轭双键结构，在可见光区有较强的吸收，未获得最佳实验效果，取对照品溶液在300nm-600nm进行扫描。结果表明，叶黄素对照品在445nm附近有最大吸收峰（见图2），故实验选择测定波长为445nm。图2 叶黄素紫外吸收光谱3.3供试品溶液的制备取同一批（201401）的越橘益视胶囊